　　實驗前需嚴格核查試劑盒有效期，確保酶標板、酶結(jié)合物、標準品、底物等組件完整無破損，且均在規(guī)定溫度下儲存。實驗室環(huán)境需保持清潔干燥，溫度控制在20-25℃，避免強光直射與交叉污染。同時，準備好移液器、洗板機、酶標儀等設備，校準移液器精度，確保洗板機通道通暢，酶標儀波長校準合格。樣本需新鮮采集，血清樣本分離后避免反復凍融，若需保存應置于-20℃以下，檢測前恢復至室溫并充分混勻。

　　（二）核心操作步驟

　　加樣：按試劑盒說明書要求，將標準品、陰性對照、陽性對照及待測樣本依次加入酶標板孔中，每孔加樣量需精準一致（通常為50-100μL），避免氣泡產(chǎn)生。加樣后輕輕振蕩酶標板，確保樣本與包被抗原/抗體充分接觸，隨后置于37℃溫育箱中孵育20-60分鐘（具體時間依試劑盒說明調(diào)整）。

　　洗板：溫育結(jié)束后，棄去孔內(nèi)液體，用洗滌液充分洗滌酶標板3-5次，每次浸泡1-2分鐘，最后一次洗滌后需將酶標板倒置在吸水紙上拍干，避免殘留洗滌液影響反應結(jié)果。洗板是去除非特異性結(jié)合物的關鍵步驟，操作不當易導致假陽性。

　　加酶結(jié)合物：向各反應孔中加入規(guī)定量的酶結(jié)合物，輕輕振蕩混勻后，37℃溫育15-30分鐘，使酶標記物與特異性結(jié)合物形成免疫復合物。

　　二次洗板：重復洗板步驟，清除未結(jié)合的酶結(jié)合物，降低背景信號干擾。

　　顯色反應：向每孔加入底物溶液，避光室溫孵育10-20分鐘，底物與酶發(fā)生催化反應，產(chǎn)生有色產(chǎn)物。顯色過程需嚴格控制時間，避免顯色過度或不足影響結(jié)果判讀。

　　終止反應：當標準品梯度顯色清晰時，加入終止液終止反應，輕輕振蕩混勻，確保反應終止，此時顏色由藍色轉(zhuǎn)為黃色（TMB底物系統(tǒng)）。

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　　檢測完成后，及時清理實驗臺面，酶標板、樣本廢棄物等按生物安全規(guī)范分類處理，避免污染環(huán)境。儀器設備需清潔保養(yǎng)，記錄實驗數(shù)據(jù)與操作過程，便于結(jié)果追溯。

　　二、結(jié)果判讀與質(zhì)量控制

　　（一）判讀方法

　　定性檢測：以陰性對照平均吸光度值（A值）的2.1倍作為臨界值（Cut-off值），待測樣本A值≥臨界值為陽性，＜臨界值為陰性。若陽性對照A值未達到試劑盒規(guī)定標準，或陰性對照A值過高，提示實驗可能存在污染或操作失誤，需重新檢測。

　　定量檢測：以標準品濃度為橫坐標，對應的A值為縱坐標，繪制標準曲線，通過曲線擬合計算待測樣本中抗原/抗體的濃度。標準曲線相關系數(shù)（R²）需≥0.98，確保擬合效果良好，否則需重新制備標準品進行檢測。

　?。ǘ┵|(zhì)量控制要點

　　實驗過程中需設置陰性對照、陽性對照及空白對照，空白對照用于扣除背景吸光度值。若出現(xiàn)對照結(jié)果異常，需排查試劑失效、加樣錯誤、洗板不好等問題。同時，平行檢測樣本需保證結(jié)果一致性，變異系數(shù)（CV）應＜10%，確保檢測結(jié)果的重復性與可靠性。

　　三、注意事項

　　操作過程中需嚴格遵循試劑盒說明書，不得隨意更改溫育時間、加樣量等參數(shù)。移液器使用時需更換吸頭，避免交叉污染；酶結(jié)合物、底物等試劑需現(xiàn)配現(xiàn)用，避免反復凍融。檢測人員需做好個人防護，穿戴實驗服、手套等防護用品，防止生物樣本感染。此外，酶標儀需定期校準，確保檢測波長準確性，洗板機需定期維護，避免通道堵塞影響洗滌效果。

　　規(guī)范的Elisa操作流程與科學的結(jié)果判讀是疾病防控血清學檢測的核心保障。在實際應用中，需強化質(zhì)量控制意識，嚴格執(zhí)行操作規(guī)范，及時排查實驗誤差，確保檢測結(jié)果準確可靠，為疾病監(jiān)測、疫情防控及臨床診斷提供有力支撐。

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