三聚氰胺檢測試劑盒

使用說明書

（酶聯(lián)免疫法）

 1 原理及用途

本試劑盒采用間接競爭ELISA方法檢測奶粉、牛奶、組織、飼料、蛋類、血清等樣本中的三聚氰胺（Melamine，MEL），試劑盒由預(yù)包被偶聯(lián)抗原的酶標(biāo)板、辣根酶標(biāo)記物、抗體、標(biāo)準品及其他配套試劑組成。檢測時，加入標(biāo)準品或樣本溶液，樣本中的三聚氰胺和酶標(biāo)板上預(yù)包被偶聯(lián)抗原競爭抗三聚氰胺抗體，加入酶標(biāo)記物后，用TMB底物顯色，樣本吸光度值與其所含三聚氰胺含量成負相關(guān)，與標(biāo)準曲線比較即可得出樣本中三聚氰胺的殘留量。

2 技術(shù)指標(biāo)

2.1 試劑盒靈敏度：1ppb(ng/ml)

2.2 反應(yīng)模式：25℃，30min～15min

2.3 檢測下限：

奶粉……………………………………20ppb

牛奶……………………………………27ppb

牛奶/奶粉（處理法二）………………1ppb

組織（雞/豬/鴨/魚/蝦/肝臟）………2ppb

飼料……………………………………100ppb

蛋類……………………………………20ppb

血清……………………………………4ppb

2.4 交叉反應(yīng)率：

三聚氰胺………………………………100%

三聚氰酸………………………………60%

三嗪、三嗪二銨………………………<1%

 2.5 樣本回收率：

牛奶、奶粉………………………90%±20%

組織………………………………85%±20%

飼料………………………………85%±20%

蛋類………………………………80%±20%

3 試劑盒組成

酶標(biāo)板……………………………96孔

標(biāo)準液：各1ml

0ppb、1ppb、3pp、9ppb、27ppb、81ppb

高標(biāo)準液（紅蓋）：1ppm…………1ml

酶標(biāo)記物（紅蓋）…………………5.5ml

抗體工作液（藍蓋）………………5.5ml

底物液A（白蓋）……………………6ml

底物液B（黑蓋）……………………6ml

終止液（黃蓋）………………………6ml

20×濃縮洗滌液（白蓋）……………40ml

2×復(fù)溶液（黃蓋）…………………50ml

說明書………………………………1份

4 需要的器材和試劑

4.1 儀器：酶標(biāo)儀、打印機、均質(zhì)器 、氮氣吹干裝置、振蕩器、離心機、刻度移液管、天平（感量0.01g）

4.2 微量移液器：單道20µl-200µl，100µl-1000µl、多道300µl

4.3 試劑：乙腈、氫氧化鈉、濃鹽酸、正己烷、甲醇

5 樣本前處理

5.1 樣本處理前須知：

實驗器具必須潔凈并使用一次性吸頭，以避免污染干擾實驗結(jié)果。

5.2 配液：

配液1：1M HCl 溶液

    取8.6ml濃HCl加去離子水至100ml。

配液2：乙腈-0.1M NaOH溶液

    84ml乙腈和16ml 0.1M NaOH混合均勻。

配液3：0.1M NaOH 溶液

    稱取0.4g NaOH加去離子水至100ml。

配液4：1M NaOH 溶液

    稱取4g NaOH加去離子水至100ml。

配液5：復(fù)溶液

將2×復(fù)溶液用去離子水2倍稀釋（1份2×復(fù)溶液加1份去離子水），用于樣本的復(fù)溶，復(fù)溶液在4℃環(huán)境可保存一個月。

配液6:工作洗滌液

    將濃縮洗滌液20倍稀釋(1份洗滌液加19份去離子水)。

5.3 樣本前處理步驟：

5.3.1 牛奶樣本處理方法：

1）取牛奶樣本600µl到2ml的離心管中，加入1ml乙腈，充分振蕩混勻；4000r/min離心5min；

2）取100µl上清液，加入900µl復(fù)溶液，混勻；

3）取50 µl用于分析。

牛奶樣本稀釋倍數(shù)：27    檢測下限：27ppb

5.3.2 奶粉樣本處理方法：

1）稱取2.0±0.05g奶粉樣本至50ml離心管中，加入4ml甲醇，充分振蕩；

2）4000r/min離心10min，取100µl上清液，再加入900µl復(fù)溶液，混勻；

3）取50µl用于分析。

奶粉樣本稀釋倍數(shù)：20    檢測下限：20ppb

5.3.3 牛奶/奶粉樣本處理方法二：

1）取2ml奶樣或2g奶粉至離心管中；

2）加入8ml乙腈-0.1M NaOH充分振蕩2min，4000r/min離心10min，取4ml上清液50-60℃下氮氣或空氣流吹至*干燥；

3）用1ml正己烷溶解干燥的殘留物后，再加入1ml復(fù)溶液，混合30s，離心去除上層正己烷相；

4）取下層水相50µl用于分析。

    樣本稀釋倍數(shù)：1    檢測下限：1ppb

5.3.4 組織（雞/豬/鴨/魚/蝦/肝臟）樣本處理方法： 

1）取2.0±0.05g均勻組織樣本于50ml離心管中；

2）加入8ml乙腈-0.1M NaOH充分振蕩2min，4000r/min離心10min，取2ml上清液50-60℃下氮氣或空氣流吹至*干燥；

3）用1ml正己烷溶解干燥的殘留物后，再加入1ml復(fù)溶液，混合30s，離心去除上層正己烷相；

4）取下層水相50µl用于分析。

     樣本稀釋倍數(shù)：2    檢測下限：2ppb

5.3.5 飼料樣本處理方法：

1）將飼料樣品研碎，稱2.0±0.05g研碎的飼料樣品，加入2ml 1M HCl，加入16ml去離子水均質(zhì)；

2）旋流1min，放振蕩器上振蕩2min；

3）4000r/min離心15min，取出10ml上清液并用1M NaOH將pH值調(diào)至6-8。（注：因飼料樣品的不同，加入1M NaOH的量有所差異，根據(jù)情況調(diào)節(jié)，一般加入范圍是0.5ml—1ml之間）

4）4000r/min 離心15min，吸出上清液（如果上清仍然渾濁可提高轉(zhuǎn)速或用濾紙過濾）；

5）取上清液用復(fù)溶液10倍稀釋（取100µl上清液加入900µl復(fù)溶液，混合均勻）；

6）取50µl進行分析。

樣本稀釋倍數(shù)：100    檢測下限：100ppb

5.3.6 蛋類樣本處理方法： 

1）用均質(zhì)器低速均勻樣本（蛋清、蛋黃或全蛋）；

2）稱取2.0±0.05g均質(zhì)過的樣本，加入8ml乙腈-0.1M NaOH充分振蕩2min；（蛋清含蛋白成份高，加入提取液后會形成一團膠狀物，較蛋黃或全蛋難搖勻，此情況為正?，F(xiàn)象不影響實驗結(jié)果）

3）4000r/min離心10min，取1ml上清液50-60℃下氮氣或空氣流吹至*干燥； 

4）用1ml正己烷溶解干燥的殘留物后，再加入1ml復(fù)溶液，混合30s，離心去除上層正己烷相；

5）取下層水相用復(fù)溶液4倍稀釋（50µl樣本液加150µl復(fù)溶液），混合30s；

6）取50µl用于分析。

 樣本稀釋倍數(shù)：20    檢測下限：20ppb

5.3.7 血清樣本處理方法： 

1）取0.5ml血清樣本于50ml離心管中；

2）加入2ml乙腈-0.1M NaOH充分振蕩2min，4000r/min離心10min，取1ml上清液50-60℃下氮氣或空氣流吹至*干燥；

3）用1ml正己烷溶解干燥的殘留物后，再加入1ml復(fù)溶液，混合30s，離心去除上層正己烷相；

4）取下層水相50µl用于分析。

樣本稀釋倍數(shù)：4    檢測下限：4ppb

6 酶聯(lián)免疫試驗步驟

    將所需試劑從4℃冷藏環(huán)境中取出，置于室溫平衡30min以上, 洗滌液冷藏時可能會有結(jié)晶需恢復(fù)到室溫以充分溶解，每種液體試劑使用前均須搖勻。取出需要數(shù)量的微孔板及框架，將不用的微孔板放入自封袋，保存于2-8℃。

6.1 編    號：將樣本和標(biāo)準品對應(yīng)微孔按序編號，每個樣本和標(biāo)準品做2孔平行，并記錄標(biāo)準孔和樣本孔所在的位置。

6.2 加樣反應(yīng)：加標(biāo)準品或樣本50µl/孔到各自的微孔中，然后加酶標(biāo)記物50µl/孔，再加入50µl/孔的抗體工作液，用蓋板膜封板，輕輕振蕩5秒混勻，25℃反應(yīng)30分鐘。

6.3 洗    滌：小心揭開蓋板膜，將孔內(nèi)液體甩干，用工作洗滌液250µl/孔充分洗滌5次，每次間隔30秒，用吸水紙拍干（拍干后未被清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破）。

6.4 顯    色：每孔加入底物液A 50µl，再加底物液B 50µl，輕輕振蕩5秒混勻，25℃避光顯色15分鐘（若藍色過淺，可適當(dāng)延長反應(yīng)時間）。

6.5 終    止：每孔加入終止液50µl，輕輕振蕩混勻，終止反應(yīng)。

6.6 測吸光值：用酶標(biāo)儀于450nm處測定每孔吸光度值（建議用雙波長450/630nm）。測定應(yīng)在終止反應(yīng)后10分鐘內(nèi)完成。

7 結(jié)果分析

7.1 百分吸光率的計算

    標(biāo)準液或樣本的百分吸光率等于標(biāo)準液或樣本的百分吸光度值的平均值（雙孔）除以*個標(biāo)準液（0ppb）的吸光度值，再乘以100%，即

A—標(biāo)準溶液或樣本溶液的平均吸光度值

A0—0ppb標(biāo)準溶液的平均吸光度值

7.2 標(biāo)準曲線的繪制與計算

    以標(biāo)準液百分吸光率為縱坐標(biāo)，對應(yīng)的標(biāo)準液濃度（ppb）的對數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準液的半對數(shù)曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標(biāo)準曲線中，從標(biāo)準曲線上讀出樣本所對應(yīng)的濃度，乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中待測物的實際濃度。

    若利用試劑盒專業(yè)分析軟件進行計算，更便于大量樣本的準確、快速分析。（索?。?/span>

8 注意事項

8.1 室溫低于25℃或試劑及樣本沒有回到室溫（25℃）會導(dǎo)致所有標(biāo)準的OD值偏低。

8.2 在洗板過程中如果出現(xiàn)板孔干燥的情況，則會出現(xiàn)標(biāo)準曲線不成線性，重復(fù)性不好的現(xiàn)象。所以洗板拍干后應(yīng)立即進行下一步操作。

8.3 混合要均勻，洗板要*，在ELISA分析中的再現(xiàn)性，很大程度上取決于洗板的*性。

8.4 在所有孵育過程中，用蓋板膜封住微孔板，避免光線照射。

8.5 不要使用過了有效期的試劑盒，不要交換使用不同批號試劑盒中的試劑。

8.6 顯色液若有任何顏色表明變質(zhì)，應(yīng)當(dāng)棄之。0標(biāo)準的吸光度值小于0.5個單位（A450nm< 0.5 ）時，表示試劑可能變質(zhì)。

8.7 反應(yīng)終止液有腐蝕性，避免接觸皮膚。

9 貯藏及保存期

儲藏條件：試劑盒于2-8℃保存，避免冷凍。

保 質(zhì) 期：該產(chǎn)品有效期為1年，生產(chǎn)日期見包裝盒。

【生產(chǎn)企業(yè)】

企業(yè)名稱：廣州創(chuàng)侖生物制品有限公司

地    址：廣州市清華科技園創(chuàng)新基地番禺石樓鎮(zhèn)創(chuàng)啟路63號二期2幢一樓全層

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